阿拉伯芥OTU1與人類OTUB1去泛素酵素
抑制酵母菌生長之能力的比較
作 者:黃奕杰
指導老師:劉玉山 老師
指導教授:符宏勇 教授
摘要
真核生物細胞透過不同機制來傳遞訊息，其中泛素
(ubiquitin)扮演很重要的角色，透過不同泛素化
(ubiquitination)
過程，胞器或者酵素間得以互相傳遞各種訊號(Sun et al., 2004)。而相對於泛素化，去泛素化
(deubiquitination)
機制也同時存在。人類去泛素酵素HsOTUB1除了有切斷K48泛素鏈功能外，尚可阻斷UBC13進行K63泛素鏈連接
(Wiener
et al., 2012)。而近期研究指出阿拉伯芥中的AtOTU1與HsOTUB1之親緣關係相近(Rajacommare
et al., 2014)。之前研究指出HsOTUB1過量表現於酵母菌中時會抑制酵母菌的生長(Juang
et al., 2012)，故推測AtOTU1應有相同表現。但本實驗發現在AtOTU1被表現於RPN10啟動子的情況下並未影響酵母菌的生長情況。HsOTUB1亦同，只於GAL1啟動子中表現出抑制酵母菌生長的能力。我們期望在後續的實驗中找出真正的原因並觀察其抑制酵母菌生長之現象。
一、研究動機
真核細胞透過許多不同的機制來傳遞訊息，其中泛素
(ubiquitin)扮演了很重要的角色，透過不同的泛素化
(ubiquitination) 過程，胞器間得以互相傳遞各種訊號，以維持細胞的正常運作(Sun
et al., 2004)。而相對泛素化而言，與其相反的反應──去泛素化
(deubiquitination)
機制同時存在於真核細胞內。
圖一、真核生物的泛素化，由E1、E2、E3三類酵素負責，E1負責活化泛素、E2負責傳遞泛素、E3則將泛素與目標蛋白質接合 ( Hicke
., 2005)
泛素化的機制 (圖一) 主要是透過泛素激活酵素 (E1)、泛素接合酵素(E2)、泛素連接酶 (E3)
將泛素連接於目標受質上並堆積成一條泛素鏈
(ubiquitin chain) 作為標記，以達成傳遞訊息的目的，而去泛素化主要藉由去泛素酵素來進行，去泛素酵素可切斷泛素之間的連結來達到調控、修飾的功能，現今生物學家將去泛素酵素歸類成五大類，而其中屬於卵巢腫瘤蛋白酶家族 (OTU) 的HsOTUB1在先前的文獻中被證實除了有切斷K48泛素鏈的能力，尚能與UBC13(E2)結合、阻斷細胞內的泛素作用 (Wiener
et al., 2012) ，這造成了細胞無法正常調控體內的蛋白質，同時使細胞修補DNA的重要途徑受損 (Nakada
et al., 2010) ，因此當HsOTUB1被過度表現在酵母菌體內時，可發現酵母菌的生長明顯受到影響
(圖二、Juang
et al., 2012)。
圖二、由上圖可見HsOTUB1以及HsOTUB1c91s過量表現於酵母菌中時，明顯抑制酵母菌的生長。(Juang et al., 2012)
經由近期研究成果顯示，阿拉伯芥的AtOTU1與人類的HsOTUB1之胺基酸序列極其相近 (圖三，Radjacommare et al., 2014) ，顯示OTU1的序列保守性相當高。而對於HsOTUB1抑制UBC13的能力是否也可見於AtOTU1，則尚無相關的研究報告發表，因此希望探討當AtOTU1基因大量表現於酵母菌中時，酵母菌的生長是否受到抑制，而這種抑制的機轉是否與HsOTUB1的抑制能力相同。
HsOTUB1用以切斷K48泛素鏈之活性位點位於第91個胺基酸，當HsOTUB1用以切斷K48泛素鏈之活性位點被突變後，其仍有抑制UBC13活性之能力 (Juang et al., 2010) ，證實其與切斷K48泛素鏈之機轉無關，故想探討AtOTU1用以切斷K48泛素鏈之活性位點被突變後是否也仍可觀察到抑制酵母菌生長的效果
圖三、OTU去泛素酵素家族演化親緣樹 (Radjacommare et al., 2014)
由圖中可見AtOTU1與HsOTUB1有相似之序列
貳、研究目的及研究問題
(一)
探討AtOTU1是否與HsOTUB1一樣具有抑制酵母菌生長的能力
(二)
比較AtOTU1、 AtOTU1c92s、HsOTUB1抑制酵母菌生長之能力，並比較HsOTUB1在不同質體、啟動子和菌株中抑制酵母菌生長之能力。
參、研究設備及器材
PCR
machine (biometra)
低溫/常溫振盪培養箱 (宏連)
無菌操作台
分光光度計
離心機 (BIO-RAD)
西方墨點法設備 (BIO-RAD)
其他一般實驗器材
肆、實驗方法與過程
(一) 製備所需質體、DNA
1. 質體 DNA 的製備與微量抽取
實驗使用的 pRS424
質體、HsOTUB1基因、AtOTU1基因原轉型於E.coli中保存，所以先將帶有 pRS424 的菌培養在固體培養基上，之後挑出單一落菌培養再使用 High Speed Plasmid mini Kit High (geneaid) 抽取 pRS424質體，儲存於 -20 ℃。
2.以PCR仲介之突變方法製備AtOTU1-C92S
(二) 將來自於酵母菌RPN10-UTR基因接進pRS424 (包含RPN10基因之啟動子)質體中
1.以PCR放大yeastRPN10之UTR
2. 限制酶水解將 pRS424質體與yeastRPN10之UTR以BamHI、SacI進行限制酶水解
使用配方如下:
成份
|
比例
|
質體或DNA片段
10X
NEB buffer
BamHI
SacI
sterile
water
|
1000~2000
ng
5
μL
1
μL
1
μL
補體積
|
total
volume
|
50
μL
|
在 37 ℃下反應 2小時，利用 DNA 電泳分析其 DNA 片段，最後使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(geneaid)將 DNA 片段回收，儲存於-20 ℃。
3. yeastRPN10之UTR與pRS424質體進行接合反應
使用配方如下:
成份
|
比例
|
質體pRS424
DNA片段
T4 DNA ligase (1 U/μL)
10X ligation buffer
Sterile water
|
100 ng
100 ng
1 μL
1 μL
補體積
|
Total volume
|
10 μL
|
將混合好的樣品於16 ℃下培養20小時，接著轉型至勝任細胞
4. 大腸桿菌的質體轉型作用 (E. coli transformation)
(1) 將質體pRS424-RPN10-UTR 10 uL 與大腸桿菌 100 uL 混和
(2) 置於冰上 20 分鐘，並每 5 分鐘輕彈管壁以混勻
(3) 置於 42 ℃ (heat
shock) 45 秒
(4)
置於冰上2分鐘
(5) 加入200uL LB broth 於37℃，培養
20 分鐘
(6) 塗抹菌液於含ampicillin(1:5000)LB 固體篩選培養基上
5. 以牙籤沾取數個單一菌落保存於新的含ampicillin(1:5000)LB
固體
篩選培養基上並編號
6. 以colony PCR之方式篩選轉型菌落
用tip尖端沾取LB培養基上劃出之菌體後加入滅菌水中，再以特定設計之引子對來進行PCR反 應。挑選有增殖出正確DNA之菌株，將這些菌株以LB broth培養後進行微量質體DNA之抽取，質體保存於 -20 ℃。
LB broth 之配方如下
成份
|
比例
|
Tryptone
Yeast extract
NaCl
sterile water
|
10 g
5 g
10 g
補體積
|
total volume
|
1000 mL
|
7. DNA定序
萃取之質體DNA送交中研院植微所核酸分析核心實驗室進行DNA定序，確認其DNA序列無誤。
(三)
將OTUB1基因與
(二)
之質體接合
1. 以PCR放大
HsOTUB1基因並純化
2. 加入限制酶NdeI、BamHI-HF
置於 37
℃，反應
3
小時
配方如下頁所示：
成份
|
比例
|
質體或DNA片段
10X
NEB buffer
BamHI-HF
NdeI
sterile
water
|
1000~2000
ng
5
μL
1
μL
1
μL
補體積
|
total
volume
|
50
μL
|
3. 電泳以確定限制酶有確實作用
4. 以NdeI、BamHI-HF處理 (二) 之質體如步驟 (三)-2.
5. 以連接酶連接HsOTUB1與質體
6. 轉型至大腸桿菌，並塗抹於含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基
7. 挑選數個單一菌落於新的含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基保存並同時進行菌落PCR
8. 挑選電泳結果符合預期之菌落進行液態培養( LB broth + ampicillin(1:5000)
)
9. 抽取培養完成之菌液的質體
10. 定序以確定DNA是否正確無突變
(四) 將AtOTU1基因與 (二) 之質體接合
1. 以PCR放大 AtOTU1 基因並純化
2. 加入限制酶NdeI、SacI 置於 37 ℃，反應 3 小時
配方如下：
成份
|
比例
|
質體或DNA片段
10X
NEB buffer
NdeI
SacI
sterile
water
|
1000~2000
ng
5
μL
1
μL
1
μL
補體積
|
total
volume
|
50
μL
|
3. 電泳以確定限制酶有確實作用，並純化
4. 以NdeI、SacI處理 (二) 之質體如步驟 (四)-2
5. 以連接酶連接AtOTU1與質體
6. 轉型至大腸桿菌，並塗抹於含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基
7. 挑選數個單一菌落於新的含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基保存並同時進行菌落PCR
8. 挑選電泳結果符合預期之菌落進行液態培養( LB broth + ampicillin(1:5000)
)
9. 抽取培養完成之菌液的質體
10. 定序以確定DNA是否正確無突變
(五)將 atOTU1C92S基因與 (二) 之質體接合
1. 以PCR放大 atOTU1C92S 基因並純化
2. 加入限制酶NdeI、EcoRI 置於 37 ℃，反應 3 小時
配方如下：
成份
|
比例
|
質體或DNA片段
10X
NEB buffer
NdeI
EcoRI
sterile
water
|
1000~2000
ng
5
Μl
1
μL
1
μL
補體積
|
total
volume
|
50
μL
|
3. 電泳以確定限制酶有確實作用
4. 以NdeI、EcoRI處理
(二)
之質體如步驟 (五)-2
5. 以連接酶連接atOTU1C92S與質體
6. 轉型至大腸桿菌，並塗抹於含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基
7. 挑選數個單一菌落於新的含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基保存並同時進行菌落PCR
8. 挑選電泳結果符合預期之菌落進行液態培養
( LB broth + ampicillin(1:5000)
9. 抽取培養完成之菌液的質體
10. 定序以確定DNA是否正確無突變
(六)
將 (三)
(四) (五)
之質體轉型進酵母菌中
1. 準備勝任酵母菌細胞
(1) 將酵母菌序列稀釋於含ampicillin(1:5000)LB
固體篩選培養基並置於 30 ℃ 三天
(2) 挑選三個單一菌落分別加入1
mL YPAD並混勻
(3) 再加入50
mL YPAD 培養於 30
℃、250
rpm 18~24小時
(4) 測其菌液對波長
600
nm 的吸光程度，若不足1.2則繼續培養，總培養時間若超過
24
小時則須 從第
(2)
步驟重作
(5) 將
50
mL 的菌液加入 300
mL YPAD 於 30
℃，培養
4
小時
(6) 離心
(3000
g, 5 分鐘) 後將上清液倒除
(7) 加入
25 mL 純水，以寬口的tip重新懸浮酵母菌，並再次離心
(
3000 g, 5 分鐘)
，倒除上清液，重複1~2次以清洗酵母菌
(8) 加入
1.5
mL 的TE-LiAC 溶液並以寬口tip重新懸浮酵母菌
(六) 酵母菌轉型
1. 準備carrier DNA
2. 酵母菌轉型
100 uL 勝任細胞
10 uL carrier DNA (salmon sperm DNA 10 mg/mL)
600 uL TE-LiAC-PEG
100 ng (三)、(四)、(五)之質體、pRS424質體(各做一組+Wild Type)
置於 30 ℃，培養 30 分鐘 (200 rpm)
3. heatshock ( 42 ℃，15分鐘)
4. 冷卻 10 分鐘
5. 離心 1 分鐘，倒掉上清液，加入 0.5 mL TE buffer並重懸
6. 塗佈於培養基如表一
|
WT yeast
|
OTU1
|
OTUB1
|
OTU1c92s
|
pRS424
|
SD-W
|
O
|
O
|
O
|
O
|
O
|
YPAD
|
O
|
X
|
X
|
X
|
X
|
|
|
|
|
|
|
(七)
比較轉型完之各株酵母菌生長之情形
1. 取單一菌落加
5mL
SD-W broth，培養於 30 ℃ 24 小時
SD-W broth配方如下：
成份
|
比例
|
Difco yeast
nitrogen without amino acid
D-sorbitol
Dropout
powder(-Adenine,-His,-Lev,-Tryp)
Adenine
Histidine
Leucine
Glucose
Sterile water
|
6.7 g
182.2 g
0.6 g
0.2 g
0.2 g
1 g
2 g
補體積
|
Total
volume
|
1000
mL
|
2.
取 50 uL 菌液加 4950 uL SD-W broth
3. 將不同株酵母菌稀釋成相同濃度
4. 10倍等比序列稀釋1到100000倍，並滴於平坦之培養基上以比較生長之情形
圖四、 此為轉型完之酵母菌序列稀釋於YPAD培養基培養之結果，第一列為植入pRS424質體之酵母菌，第二到第四列依序為過量表現AtOTU1、HsOTUB1、Atotu1c92s之酵母菌，最左邊滴加 5 uL OD600吸光度0.7之菌液，由左至右滴加之菌液濃度以十倍遞減，並培養於 30 ℃
三天。
由此實驗之結果我們明顯觀察到AtOTU1、HsOTUB1、Atotu1c92s基因對酵母菌生長沒有抑制的情況，為確認各蛋白的表現對酵母菌的影響，以西方墨點法來確認其表現量
(八)西方墨點法
圖(五)，此圖為西方墨點法之結果，由左到右依序為 empty vector、AtOTU1、atOTU1C92S、HsOTUB1(2重複)，因AtOTU1、atOTU1C92S、HsOTUB1之分子大小均約為37Kd，由此圖並未能檢測到HsOTUB1的表現
由於抗體均使用AtOTU1的抗體，因此無法確定HsOTUB1為不表現或不被抗體辨識，因此以HA3-tag接於HsOTUB1來確認其表現並更換不同的啟動子、菌株、質體重複上述實驗以作為比較
(九) GAL1 Construct
1.以PCR放大HsOTUB1、AtOTU1、AtOTU1cs
2.以BamHI、SalI對HsOTUB1基因及pRS426進行酶切
成份
|
比例
|
質體或DNA片段
10X NEB buffer
BamHI
SalI
sterile water
|
1000~2000 ng
5 μl
1 μL
1 μL
補體積
|
total volume
|
50 μL
|
3.將酶切後的DNA片段與質體進行接合
成份
|
比例
|
質體pRS426
DNA片段
T4 DNA ligase (1 U/μL)
10X ligation buffer
Sterile water
|
100 ng
100 ng
1 μL
1 μL
補體積
|
Total volume
|
10 μL
|
4. 轉型至大腸桿菌，並塗抹於含乳糖LB
固體營養篩選培養基(SD-Ura)
5.培養於
37℃ ,18 小時，並觀察其生長結果
(十)HA3-tag-HsOTUB1 construct
1.以PCR放大HsOTUB1
2.以BamHI、NcoI對p1239(HA3-tag
included)、HsOTUB1進行酶切
3.將酶切後的DNA片段與質體進行接合
成份
|
比例
|
質體p1239
DNA片段
T4 DNA ligase (1 U/μL)
10X ligation buffer
Sterile water
|
100 ng
100 ng
1 μL
1 μL
補體積
|
Total volume
|
10 μL
|
4. 轉型至大腸桿菌
5. 定序以確認基因轉植成功
6.以BamHI、SalI切下已接上tag的HsOTUB1並接於GAL1-pRS426
construct中
7.轉型進大腸桿菌
8.菌落PCR確認轉型成功
9.轉型至酵母菌並培養於含乳糖LB 固體營養篩選培養基(SD-Ura) 及含棉子糖LB 固體營養篩選培養基(SD-Ura) ，30℃ 三天，並觀察其生長結果
(十一)更換酵母菌株
1.將pRS424-rpn10-HsOTUB1 construct、pRS426以KpnI、SacI進行酶切
2.將pRS426與rpn10-HsOTUB1接合
3.轉型於大腸酵母菌(BY4741)，並塗布於LB 固體營養篩選培養基(SD-Ura)
4.培養於30℃ 三天，並觀察其生長結果
伍、研究結果
(一) pRS424-rpn10 construct
圖一、HsOTUB1、AtOTU1、AtOTU1cs pRS424-rpn10 construct的酵母菌轉型序列稀釋的結果
由圖一看出我們未能觀察出AtOTU1、AtOTU1cs有抑制酵母菌生長的能力，而令人驚訝的是HsOTUB1也未如以發表論文所述表現出抑制酵母菌生長的現象，因此以西方墨點法來確認個蛋白質的表現量藉以釐清圖一所代表的意義
圖二、上圖為西方墨點法的結果，右四為重複操作
因實驗室中暫無HsOTUB1之抗體，且AtOTU1與HsOTUB1之序列相近，理論上可以成功辨認，故只以AtOTU1之抗體進行西方墨點法，但因上圖並無HsOTUB1之訊號，所以由圖二我們僅確定AtOTU1、AtOTU1c92s有表現且可能沒有抑制酵母菌生長的能力，而HsOTUB1則須再以HA3-tag來確認其表現與否
(二)HA3-tag
construct
圖三、菌落PCR之結果
HA3-tag-pRS426/HsOTUB1的E.coli
轉型結果，可確定已轉型正確DNA大小
正在進行定序以及再確認的階段
(三)
pRS426-GAL1 construct
圖四、將轉型後的酵母菌序列稀釋並分別以乳糖及葡萄糖環境培養
由圖四可以看出，HsOTUB1在GAL1啟動子中被乳糖活化時如同前人研究所述確實可以抑制酵母菌之生長，且AtOTU1與AtOTU1CS均表現出抑制酵母菌生長的現象。遂以生長曲線量化結果。
圖五、pRS426-GAL1
construct 酵母菌生長曲線圖
由圖五可看出四株酵母菌在葡萄糖環境下的生長曲線(虛線)高度重疊，證明這四株酵母菌在不受外來基因干擾時期生長能力一致，並且從實線的部分可以確認酵母菌的生長確實會受到HsOTUB1、AtOTU1、AtOTU1CS影響
(四) 更換酵母菌株
圖六、左側為空白pRS426質體，右側為含有HsOTUB1之pRS426質體
同樣使用rpn10啟動子的情況下，更換酵母菌株及質體種類仍然無法觀察到HsOTUB1抑制酵母菌生長的現象
陸、結論
(一)AtOTU1,AtOTU1CS於RPN10啟動子中表現時不影響酵母菌的生長，但未能確定HsOTUB1的表現與影響
(二)AtOTU1,HsOTUB1,AtOTU1CS於GAL1啟動子中表現時均可以抑制酵母菌的生長
(三)質體的選擇並不是影響AtOTU1,HsOTUB1,AtOTU1CS抑制酵母菌生長之能力的因素，而為了更精確的觀察RPN10表現蛋白質的情況，未來會將HsOTUB1、AtOTU1、AtOTU1CS以HA3-Taq標記，以比較其在RPN10啟動子中表現的狀況與對酵母菌生長的影響
柒.討論
在pRS424-rpn10
construct中並沒有觀察到AtOTU1、AtOTU1CS、HsOTUB1抑制酵母菌生長的能力，改用參考論文所使用的乳糖操縱子來表現時，各蛋白質卻都抑制了酵母菌的生長。這個實驗結果跟預想的完全不符，因為RPN10啟動子是持續表現的啟動子，蛋白質的表現量應該比乳糖操縱子的GAL1啟動子多的多，但在以RPN10啟動子表現AtOTU1、AtOTU1CS、HsOTUB1時卻沒有抑制酵母菌生長的情形，反而是GAL1啟動子表現的蛋白質有抑制酵母菌生長的現象。為了釐清原因，進一步以pRS426質體來表現HsOTUB1來探討抑制酵母菌之能力是否跟質體有關，結果RPN10啟動子在pRS426質體中表現AtOTU1、AtOTU1CS、HsOTUB1時仍舊沒有抑制酵母菌生長的現象，因此AtOTU1、AtOTU1CS、HsOTUB1在RPN10啟動子中不抑制酵母菌生長之原因尚未明瞭，未來還要再設計實驗去討論。
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